RNA聚合酶II（Pol II）是真核生物細胞核中負責合成mRNA的核心機器🍳。Pol II的C端結構域（C-terminal domain, CTD）在轉錄的過程中經歷動態的磷酸化修飾：未磷酸化的Pol II通過磷酸化進入轉錄起始階段🙋🏿‍♂️，隨後進一步磷酸化進入延伸階段，並在轉錄終止時達到最高磷酸化水平。然而🦇，高磷酸化的Pol II如何轉變為未磷酸化狀態🏃‍♀️‍➡️，並重新進入轉錄再起始的分子機製仍不清楚。此外✌🏻，Pol II的磷酸化修飾與RNA加工事件緊密偶聯🥥，但在轉錄終止後再起始的過程中🆕，Pol II的去磷酸化如何與RNA加工協同完成的機製也尚未闡明。

論文截圖

近日👩‍🍳💁🏼，意昂3体育官网生命科學學院🧶、意昂3体育-清華生命科學聯合中心季雄團隊在Nature Communications發表了一篇題為“CTDP1 and RPB7 stabilize Pol II and permit reinitiation”的研究論文，該研究深入探討了Pol II在轉錄終止後重新起始過程中的調控機製。研究結果顯示，Pol II亞基RPB7與磷酸酶CTDP1相互作用🤦🏻‍♀️，促進Pol II去磷酸化😴，並維持Pol II蛋白穩定🪘，進而協助轉錄終止後的重新起始。值得註意的是，RPB7在RNA聚合酶復合物中定位於RNA輸出通道口，這一特殊定位使其能夠與多種RNA結合蛋白發生特異性相互作用👨‍🦲，從而參與RNA加工過程的調控🕟😢。這種獨特的空間構象和功能定位為轉錄終止與共轉錄RNA加工的協同完成提供了結構基礎。

季雄團隊此前利用蛋白質瞬時降解聯合多種功能基因組研究技術，系統研究了Pol II的12個亞基的異質性¹🏞，並揭示了亞基RPB3通過CBC-PCF11通路特異性調控核糖體蛋白基因的3'末端加工過程²🥟，表明亞基存在特異性的基因表達調控功能。在此基礎上，本研究進一步聚焦Pol II莖部結構域的獨特亞基RPB7🔍，以探究其在哺乳動物細胞中的功能特性。

研究人員結合非標記定量質譜（Label-free MS）分析以及蛋白質免疫印跡（Western blot）實驗，發現RPB7的缺失會導致Pol II大亞基（RPB1）蛋白水平顯著下降。此外🤏🏿，環區缺失的RPB7突變體也無法穩定RPB1，而當使用CDK9激酶抑製劑抑製RPB1的磷酸化水平後，低磷酸化狀態的RPB1得以穩定👶🏽。為了進一步解析這一機製🧤🚴‍♀️，研究人員借助TurboID鄰近標記技術對RPB1的鄰近蛋白質組進行定量分析，結果顯示RPB7缺失後，磷酸酶CTDP1與RPB1互作水平顯著下降。而CTDP1的缺失同樣會導致RPB1蛋白水平降低😶。此外，研究人員還發現，當同時刪除RPB1羧基端的Linker和CTD區域後📎，RPB1的穩定性不再受RPB7和CTDP1調控👷🏽‍♂️💶。

此外，研究人員還發現E3泛素連接酶CUL3的敲除能夠挽救RPB7或者CTDP1缺失所導致的高磷酸化RPB1降解👶🏻。細胞組分分離實驗表明，高磷酸化RPB1無法結合染色質，這意味著RPB7和CTDP1在穩定RPB1的同時，促進其重新結合到染色質上。為進一步驗證兩者在Pol II轉錄再起始中的作用🚵🏽，研究人員利用轉錄暫停釋放實驗（DRB release-Pol II ChIP-seq）發現，RPB7或者CTDP1的缺失均會導致Pol II在轉錄起始位點的再起始效率下降。此外，RPB7的缺失還會導致低磷酸化Pol II在轉錄起始位點的結合能力下降🙋‍♂️，而CTDP1的缺失則無此影響💧🩴。

進一步的互作蛋白質組數據分析表明，相較於Pol II其他亞基🕴🏼，RPB7與多種RNA加工因子具有更強的相互作用，並且能夠影響這些因子與Pol II的互作🐀。通過對RPB7缺失前後的RNA-seq數據進一步深入分析，鑒定出117個轉錄通讀事件❤️‍𓀌。CTDP1缺失同樣引發了類似現象🧢。此外，RPB7和CTDP1的缺失還會影響RNA剪接過程，導致外顯子比例下降。這些結果一致表明RPB7與新生RNA加工過程密切相關💁‍♂️。

綜上所述，本研究鑒定到Pol II亞基RPB7的關鍵互作蛋白——磷酸酶CTDP1，並揭示了RPB7與CTDP1協同調控Pol II蛋白穩定性及其轉錄再起始過程的分子機製。這一調控過程受到激酶CDK9💆🏼‍♂️、E3泛素連接酶Cullin 3、RPB7的環區、RPB1的CTD及其Linker區域的調控🏌🏻‍♀️。此外，RPB7緊鄰Pol II復合物的RNA出口通道🤰🏽，並與RNA加工因子相互作用，參與RNA加工過程的精細調控。這些發現不僅加深了對Pol II在轉錄終止後如何重新啟動新一輪轉錄過程的理解🙇，也為共轉錄RNA加工調控研究提供了新的思路👩‍🎨。值得註意的是8️⃣🐎，CTDP1已被證實與多種疾病有關，包括先天性白內障、面部畸形、神經病變綜合征³♜。因此，該研究揭示的CTDP1在轉錄循環中的關鍵調控功能🤏🏼，將為探索相關疾病的發病機製提供重要線索。

圖1. CTDP1和RPB7協同調節Pol II轉錄循環中的蛋白穩定性及RNA加工。Pol II在轉錄終止時，需要進行去磷酸化。RPB7可以招募CTDP1對Pol II進行去磷酸化，並進一步促進低磷酸化Pol II在基因啟動子處重新啟動新一輪轉錄。一旦RPB7或CTDP1的功能受損，共轉錄RNA加工過程將出現缺陷👧🏽，高磷酸化Pol II會在核質中積累🦹🏼，最終被E3泛素連接酶CUL3的蛋白降解途徑所清除☺️，該過程依賴CDK9、CTD以及Linker區域

季雄為該論文的通訊作者，生命科學學院博士生鄭浩楠和許杞欽為該論文的共同第一作者。意昂3体育官网生命科學學院博士生季德洵和已畢業本科生楊博欽為該工作提供了重要幫助🧑🏼‍✈️。該工作得到國家自然科學基金原創探索項目、意昂3体育-清華生命科學聯合中心、核糖核酸北京研究中心（BEACON）、啟東創新基金💴、成都研究院前沿創新基金、基因功能研究與操控全國重點實驗室✅、細胞增殖與分化教育部重點實驗室和科技部國家重點研發計劃的資助，以及意昂3体育官网鳳凰工程多個儀器平臺的大力支持🧕🏻。

參考文獻：

1. Li, Y. et al. Targeted protein degradation reveals RNA Pol II heterogeneity and functional diversity.  Molecular cell 82, 3943—3959 e3911, doi:10.1016/j.molcel.2022.08.023 (2022).

2. Li, Y. et al. RNA Pol II preferentially regulates ribosomal protein expression by trapping disassociated subunits.  Mol Cell 83, 1280—1297 e1211, doi:10.1016/j.molcel.2023.02.028 (2023).

3. Varon, R. et al. Partial deficiency of the C-terminal-domain phosphatase of RNA polymerase II is associated with congenital cataracts facial dysmorphism neuropathy syndrome.  Nature genetics 35, 185—189, doi:10.1038/ng1243 (2003).