DNA堿基編輯工具的進步為疾病治療帶來了巨大的希望🌗，可修復由單核苷酸多態性（SNPs）【1】引起的單基因遺傳疾病。目前，胞嘧啶堿基編輯器和腺嘌呤堿基編輯器主要依靠脫氨酶將胞嘧啶（C）或腺嘌呤（A）轉化為尿嘧啶（U）或肌苷（I），脫氨後的U和I會分別被識別為胸腺嘧啶（T）和鳥嘌呤（G），從而促進C-to-T和A-to-G堿基變化【2-4】。在此基礎上，進一步引入DNA糖基化酶切割中間產物U或I，產生無尿嘧啶/無嘧啶位點（AP位點），可以實現堿基的顛換，包括C-to-G轉換的CGBE【5、6】和A-to-T/C轉換的AYBE【7、8】。但以上堿基編輯工具均依賴脫氨酶，限製了它們編輯T和G的能力7️⃣，並且由於脫氨酶的過表達會引起一定的脫靶效應🤵‍♀️。

2024年7月30日，意昂3体育官网魏文勝課題組在Nature Communications雜誌在線發表題為 “Programmable DNA pyrimidine base editing via engineered uracil-DNA glycosylase”的研究論文🫄🏼，報道了一種名為TBE（Thymine base editor）的不依賴脫氨酶的DNA堿基編輯工具🧏🏽‍♀️。與現存的其他胸腺嘧啶編輯工具相比，TBE表現出更高的編輯效率、更小的細胞毒性和更低的脫靶現象⛄️。

圖1: 不依賴於脫氨酶的堿基編輯器

研究人員關註到人源化尿嘧啶DNA-糖基化酶（hUNG）的兩個突變體可以在體外實現對胞嘧啶和胸腺嘧啶的直接切割【10】🧑‍🏭。因此🙍‍♀️，通過將hUNG突變體與Cas9蛋白結合，sgRNA靶向編輯位點可以在體內實現對DNA序列中的C和T的直接編輯（圖1），其中在報告系統上編輯C的效率可達到30%🧖🏼🛏，與現存的CGBE編輯效率類似💆🏻‍♀️🧑🏽‍🍳，但針對T的hUNG突變體編輯效率較低。

為了進一步提高胸腺嘧啶的編輯效率，研究人員通過對UNG結構理性設計👨‍🔬、同源蛋白檢索🐕‍🦺、定向進化篩選的策略找到了來自耐輻射奇球菌（Deinococcus radiodurans）的尿嘧啶DNA-糖基化酶（DrUNG）突變體可以在多個人類基因組位點上實現高效的胸腺嘧啶編輯（圖2），編輯結果顯示平均T-to-C, T-to-G及T-to-A的比例為52%，30%和18%。通過優化連接氨基酸、引入具有合成傾向性的DNA聚合酶，還可以進一步提高編輯效率與編輯純度。全面評估顯示，TBE在基因組或轉錄組水平上都不會導致嚴重的脫靶編輯🍆，這表明其具有高度的編輯特異性🚶‍♂️。

圖2: TBEs在人類基因組多個內源位點實現高效的編輯

近期🐳，多個團隊也報道了基於人源化糖基化酶的胸腺嘧啶堿基編輯器【11-12】🫅🏽。通過比較32個內源位點編輯結果🤜🏿，研究人員發現與基於人源的胸腺嘧啶堿基編輯器相比，TBE展現出更高的編輯效率。此外🫰，細胞毒性實驗也表明TBE具有更小的細胞毒性。

最後🪬，通過將DrUNG突變體的mRNA與nickase SpCas9融合蛋白和sgRNA共轉染到原代成纖維細胞中的α-L-艾杜糖醛酸酶缺陷細胞中，可以觀察到該酶活性的恢復，證明了TBEs在相關疾病治療方面的潛在應用前景。

意昂3体育官网/昌平實驗室魏文勝課題組博士後伊宗裔、博士後張小雪、博士研究生魏曉旭🧑‍⚖️、本科生李佳怡（2024級研究生新生）為論文的共同第一作者。本研究獲得了國家自然科學基金🌍🫢，昌平實驗室👨🏽‍💻，意昂3体育-清華生命科學中心及中國博士後科學基金資助。

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