4月30日，意昂3体育官网未來技術學院、意昂3体育-清華生命科學聯合中心陳知行研究員課題組與德國科隆大學合作，在Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A.雜誌上發表了題為“An Aldehyde-crosslinking Mitochondrial Probe for STED Imaging in Fixed Cells” 的研究論文👩🏿‍🎤。該研究報道了一款適用於STED顯微鏡的線粒體內脊染料PK Mito Orange Fix（PKMO FX）🧘‍♂️👨‍🏫，其不僅能實現對活細胞線粒體的STED成像🚷，在細胞經過甲醛或戊二醛等常用醛類固定液固定後🐨，依然能高效保留線粒體熒光，實現對固定細胞的線粒體STED成像（圖1）以及光電聯用線粒體超分辨成像（STED-CLEM）🚴🏿🤷🏻。

論文截圖

陳知行課題組在過去幾年的時間裏研發了PKMito系列線粒體內脊超分辨探針（PNAS 2022 cover story, ChemSci 2020），在國內外得到了廣泛的應用🚶🏻‍♂️‍➡️。德國科隆大學細胞成像平臺Christian Jüngst博士自2022年起就利用PKMito Orange探針支持多個線粒體、衰老等方向的前沿課題（Nat. Commun. 2022, 6704）。Jüngst博士與陳知行課題組經常進行討論🏄🏼‍♀️，提出了一個設想💇🏼‍♂️：活細胞線粒體染料經過固定之後往往喪失大部分線粒體定位，能否設計一款能夠在固定後仍可以進行STED內脊成像？這樣可以兼容其他的固定細胞熒光標記策略💅🏻，還可以方便保存更多細胞生物學實驗室的樣品，利於超分辨顯微成像的進一步普及。

圖1：PK Mito Orange Fix標記的HeLa細胞經戊二醛固定後的線粒體多層STED成像。比例尺：5μm

線粒體探針大多依賴於線粒體膜電位(MMP)來驅動帶一個帶正電的分子特異性定位線粒體👎🏿🎭。雖然這些探針在活細胞成像時表現良好🤷‍♀️，但當細胞固定時，線粒體MMP快速改變，非共價的線粒體探針會迅速擴散出線粒體，隨之沾染在附近的脂質結構如內質網上，導致固定細胞線粒體成像一直存在亮度低⚇、信噪比差等問題。長期以來🤙🏼，發展可固定的線粒體探針的思路是在探針上偶聯一個可以與蛋白質的親核殘基反應的活性基團，例如目前最常用的可固定線粒體染料MitoTracker系列采用苄氯與蛋白的Cys反應😗，形成共價連接。然而，受限於蛋白與染料低的共價交聯效率，這些染料在固定後的成像效果並不盡人意。且隨著超分辨顯微成像的發展🪡，誕生於20世紀的MitoTracker系列染料的光學性質已經不能滿足STED成像的需求，在活細胞STED成像上表現不佳✍🏼，更難用於固定細胞STED成像。

該研究在課題組之前關於PK Mito Orange研究的基礎上，沿用Cy3.5這一適用於線粒體STED成像的染料母核💃，進一步發展可固定的線粒體探針♝。作者在Cy3.5上偶聯一些常用的共價反應基團🧓，如苄氯👩🏻‍✈️、NHS酯等👩🏼‍🎤，得到的可共價探針在細胞固定後效果欠佳。作者轉變思路，將伯胺偶聯在Cy3.5上，雖然末端為氨基的Cy3.5在活細胞染色時不能與蛋白共價交聯，但在加入醛類固定液後可基於胺與醛的快速縮合反應，實現蛋白-染料-固定液之間的高效交聯。作者將該探針命名為PKMO FX，這種策略也被稱為“固定驅動的化學交聯”（圖2）🦎。

圖2：PKMO FX探針與傳統可固定線粒體探針采用不同的交聯策略

作者比較了各種可固定染料在固定前後線粒體的熒光保留率和圖像信噪比，PKMO FX表現最優，此兩項性能均有大幅提升🧟‍♀️。作者展示了細胞經PKMO FX染色🦇、醛類固定液固定後的線粒體STED成像圖，圖像可見清晰的線粒體內脊，分辨率低至約70nm💪🏽。多層層掃STED成像展示了線粒體在Z方向上形態的多樣性。PKMO FX也適用於包括癌細胞、心肌細胞🏌🏿、神經元，以及蛋白缺陷型細胞在內的多種細胞系的超分辨成像。

進一步地✍🏼👩🏿‍🦲，作者將PKMO FX與其他多種兼容固定的標記方法聯用，包括表達熒光蛋白、自標記蛋白標簽🏊‍♂️、共染其他可固定染料🍤、代謝標記以及免疫熒光標記，實現對細胞的多種細胞結構的固定後多色成像（圖3）☁️。

圖3：PKMO FX探針標記的線粒體內脊與免疫標記的Actin。比例尺：1μm

作者將PKMO FX用於光電鏡聯用（CLEM），在電鏡成像圖上“點亮”線粒體超微結構。進一步地🧘🏼‍♀️，他用SYBR Gold 染色的mtDNA與PKMO FX染色的線粒體內脊實現了雙色CLEM🧝‍♀️，以高的定位精度在電鏡圖上標記mtDNA🧛🏼‍♀️。實驗表明，mtDNA主要分布在線粒體脊內大的空腔處📩，這是單獨使用EM難以觀測到的🧻。線粒體信號架起了其他熒光通道與電鏡圖像的橋梁，有望成為CLEM領域的新工具🌑。

圖4：PKMO FX探針實現線粒體內脊與mtDNA的雙色光電聯用成像。比例尺🏓😚：3μm

綜上🙍🏼，作者采用了一種新的生物偶聯策略，開發出了一種兼容固定細胞STED成像的新型線粒體探針。PKMO FX既具有優良的光學性質，又能在固定後保持強線粒體熒光，首次實現了僅通過小分子染料實現對固定細胞線粒體內脊超微結構的可視化。

意昂3体育官网未來技術學院2020級博士生陳婧婷為本文第一作者。陳知行和Christian Jüngst為本文的共同通訊作者。此外，本工作還得到哥廷根大學/馬克斯·普朗克研究所Stefan Jakobs課題組的合作支持🔥🧻。陳知行課題組自2018年建立以來，一直致力於研發新型熒光探針💆🏿‍♀️，努力打造國際領先的系列尖端成像試劑⛩，助力細胞生物學與未來成像技術的交叉融合與協同發展🧛🏼‍♂️。