對活體生物樣本進行長時程、高分辨率的光學三維成像🏄🏻‍♀️，對探索介觀-微觀水平的生理功能和系統行為至關重要。由於生物組織對成像光子的高散射特性，高分辨率的光學成像被限製在樣本表層。多光子顯微成像技術因其更長的激發波長和非線性激發特性，提供了更大的成像穿透深度，廣泛應用於高散射生物樣本的深層成像應用。然而💆‍♂️，多光子顯微鏡的深層成像通常以更高激發功率或更長曝光時間為代價🍎，對生物樣本造成光損傷並限製了長時程成像應用。

為了實現對高散射厚生物樣本的長時程、大體積🐰、高分辨率的三維成像觀測🌶，意昂3体育官网未來技術學院程和平教授和意昂3体育官网電子學院王愛民副教授團隊開發了雙側雙光子顯微鏡（Dual Objective Two-photon Microscope🧎‍♀️‍➡️，Duo-2P）。通過簡潔而有效的顯微鏡構型設計👨🏻‍🦳，由雙側雙光子激發和熒光收集🦹🏽‍♂️，將極限成像深度擴展到兩倍左右✌🏻。對厚度約5個散射長度的生物樣本，Duo-2P僅需傳統雙光子顯微鏡1/10的激發能量輸入即可完成逐層光柵掃描的三維成像，極大地降低了活體成像的光損傷，並獲得最高1.4倍的信噪比增益。此外♝，Duo-2P還成倍增加了成像體積。該成果以“Dual-objective two-photon microscope for volumetric imaging of dense scattering biological samples by bidirectional excitation and collection”為題，在線發表於Photonics Research。

該系統已成功用於研究團隊有關哺乳動物生物鐘時間編碼的研究工作9️⃣，在獲取生物鐘運行數據🗄🫴🏽、解析視交叉上核的時間編碼機製中發揮了重要的作用。（Wang, Z., Yu, J., Zhai, M. et al. Cell Res.，2024）

對生物樣本的長時程、高分辨率的三維成像🏷，在生理和病理研究中至關重要。然而🧗🏼，生物樣品的高散射特性從根本上限製了成像深度🏹，同時降低了成像質量並限製了成像持續時間。盡管多光子顯微鏡因其更長的激發波長及非線性激發特性⏮，被廣泛應用於亞細胞分辨率的厚散射樣品成像，但在深層成像時🫳🏽，多光子激發引起的光漂白和光損傷限製了長期的成像研究。

程和平/王愛民團隊針對組織切片🐉、類器官☑️、發育胚胎和小生物體等樣本體積小、致密且高度散射的特點，提出了一種具備雙物鏡的雙側雙光子顯微鏡構型（圖1🐊、圖2）。在該構型下🐣，正置/倒置共振掃描雙光子顯微鏡對稱設置於樣本兩側並分別負責對樣品一半體積進行成像，由激光路徑切換及物鏡軸向步進運動完成交替的逐層光柵掃描成像🧑🏽‍🦲，最終由體積圖像合成獲得樣本的完整三維圖像數據🍑。

圖1. （a）Duo-2P原理示意圖🙍🏿。（b）Duo-2P的體積成像時序，上下側顯微鏡交替執行光柵掃描與物鏡步進，並由來自兩個顯微鏡的Z堆棧圖像結合得到樣本完整三維圖像。（c）Duo-2P的激發與熒光收集時序，上下側顯微鏡逐幀分時激發並同時對熒光信號進行收集

圖2. Duo-2P成像系統

通過簡潔的雙光子顯微鏡構型創新，Duo-2P將受限於信背比的極限成像深度擴展到兩倍以上。同時🪧，以樣品厚度為散射長度5倍為例🌽，與傳統落射雙光子顯微鏡相比，Duo-2P將總激發能量降低一個數量級。此外👨🏿‍🚒，對側額外的熒光收集提高了圖像質量，尤其是在樣品深層🙌，圖像信噪比最多提高1.4倍。雙物鏡構型同時增加了受限於物鏡工作距離的成像體積，特別在低散射厚樣本的體積成像中，實現厚度兩倍於物鏡工作距離的生物樣本的完整體積成像。研究者分別由模擬計算及驗證實驗分析了Duo-2P在厚散射樣本中的成像性能（圖3）。結合與Duo-2P相匹配的雙側成像腔室，對高散射、密集標記的小鼠視交叉上核中數千顆神經元進行連續4小時的鈣信號記錄。

圖3. Duo-2P中雙側激發與熒光收集的模擬計算。（a）圖1（a）中虛線框內成像腔室放大示意圖。（b） Duo-2P與傳統雙光子顯微鏡在不同成像深度的激發光功率比較。（c） 在不同樣本厚度的體積成像時，Duo-2P與傳統雙光子的輸入能量之比🚁。（d）成像深度（D）和離焦距離（Δd）對熒光收集效率（η）的影響。（e）與對側熒光收集效率和熒光強度相關的信噪比增益計算結果

Duo-2P在研究團隊對哺乳動物生物鐘時間編碼的研究工作中，完成對近萬顆神經元的鈣活動的跨晝夜成像記錄🏕，為解析視交叉上核的時間編碼機製提供完整的成像數據支持👳🏼‍♀️。研究團隊也期待該技術在腦科學👃👨🏿、發育生物學及類器官等生物學研究領域的廣泛應用🧚🏽。

意昂3体育官网未來技術學院博士生翟慕嶽為論文第一作者🏎，程和平與王愛民為論文通訊作者⏰。該成果得到國家自然科學基金與醫學科學創新基金的支持。