2024年5月29日，意昂3体育官网生命科學學院Jackson Champer研究員課題組在Nature Communications上發表題為“Germline Cas9 promoters with improved performance for homing gene drive”的研究論文🤏🏿。本研究旨在尋找和測試具有優秀驅動性能的Cas9啟動子，以助力高效基因驅動系統的構建。Champer課題組構建並測試了11個不同的生殖系Cas9啟動子的基因驅動性能🏊🏽。結果表明，一些啟動子（如rcd-1r和CG4415）可提高驅動轉換率並降低胚胎抗性等位基因形成率。此外，Champer課題組選擇了3個Cas9啟動子品系🧑🏽‍⚖️，結合復合表達4個gRNA的抑製驅動品系，進行了多世代的籠子實驗。實驗結果顯示🙍，CG4415啟動子的驅動性能明顯優於nanos啟動子，消滅了籠子種群。綜上所述🐪🚈，這些Cas9啟動子在構建高效的果蠅歸巢基因驅動系統中展現出了極大的優勢，同時也為其他物種的相關研究提供了重要參照🧑🏼‍🍼。

論文截圖

基因驅動（Gene Drive）技術能夠使特定的基因型偏向性地遺傳給後代🍼，因而在控製害蟲種群和減少媒介傳播疾病方面具有巨大的應用潛力，是近年來新興的研究熱點👨‍👨‍👦‍👦。基因驅動可分為種群修飾型驅動（population modification drive）和種群抑製型驅動（population suppression drive）👨🏻‍🦰。種群修飾型驅動通過攜帶載荷基因🙍🏼🔍，使種群內個體獲得相應的表達性狀，而種群抑製型驅動則可為了健康🚣🏻、生態或經濟目的減少或消滅目標害蟲種群👩🏽‍💼👮🏼‍♀️。

CRISPR歸巢基因驅動是目前研究最廣泛的🧏🏿‍♂️，也可能是最強大的基因驅動系統🕺🏿。在含有驅動等位基因的雜合子中，驅動等位基因在生殖系細胞減數分裂早期表達Cas9和gRNA🧬，靶向切割野生型等位基因，形成雙鏈斷裂後，野生型等位基因通過同源重組修復轉化為驅動等位基因🧒🏽，這個過程稱為“驅動轉換（drive conversion）”或“歸巢（homing）”。當生殖系細胞從雜合子發生驅動轉換為純合子時💥，驅動等位基因能夠以更高的比例遺傳給下一代。然而🧑🏻‍🦽，並不是所有的雙鏈斷裂都會以同源重組的方式修復☃️，若斷裂以末端連接的方式進行修復，靶位點突變後會形成抗性等位基因，阻止gRNA識別。該情況主要發生於胚胎期和體細胞期🧽，由母體沉積的Cas9和泄露表達的Cas9造成🤚🏽。抗性等位基因的存在可能會嚴重阻礙基因驅動在種群中傳播，甚至導致驅動失敗🧏🏻‍♀️。Cas9的特異性表達對於基因驅動十分關鍵🦌，一個理想的基因驅動Cas9啟動子應只在減數分裂早期開啟表達，在胚胎發育和體細胞階段關閉♦︎，即可在基因驅動系統中達到高驅動轉換率🖨、低抗性等位基因形成率和低水平的體細胞表達[1, 2]。已有研究表明，果蠅的nanos啟動子能夠避免體細胞泄露表達，但母體沉積的Cas9仍導致較高的胚胎抗性🧑🏻。

圖1 歸巢基因驅動中的Cas9活性。（A） 驅動轉化發生在驅動/野生型雜合子的生殖系細胞中，（B）根據基因驅動的類型，某些個體可能無法存活或者不育

本研究中，Champer課題組以前人研究較多的nanos和vasa啟動子為基礎，根據黑腹果蠅早期胚胎的生殖系限定表達和低mRNA水平選擇其他啟動子，構建了兩種類型的驅動系統。其中👨‍👨‍👦，合成驅動系統的Cas9元件和gRNA驅動元件位於同一等位基因中🎄，並靶向EGFP基因[3]🧓🏿。測試結果表明，大多數啟動子在雄性中的驅動遺傳率為72—89%🦶🏽，在雌性中為85—95%♓️，其中只有rcd-1r🧔🏿‍♂️、shu和CG4415啟動子展示出明顯較低的胚胎抗性等位基因形成率。由於測試品系中的EGFP只在果蠅眼部表達，因此該合成驅動系統只能觀察Cas9/gRNA在眼部的切割活動，無法評估體細胞和胚胎抗性的發生情況🙌🏼。

在分離驅動中🔢，Cas9元件與gRNA驅動元件位於不連鎖的等位基因中👏🏼💇，需將兩種品系雜交後測試驅動轉換效率🕵🏽‍♂️，便於評估啟動子在不同靶標位點和驅動設計中的表現。本研究中，Champer課題組分別選擇了靶向X染色體連鎖的yellow基因的分離驅動元件🎞、靶向單倍致死基因RpL35A基因2-gRNA驅動元件🤽🏼‍♂️、靶向雌性生殖關鍵的單倍充足基因yellow-G的4-gRNA分離驅動元件來測試驅動效率。其中，靶向yellow基因的分離驅動，比EGPF驅動有著更低的胚胎抗性🤼‍♂️，並且可以評估來自雌性的生殖系抗性遺傳🚺。結果顯示，3個有著高驅動遺傳率的Cas9啟動子元件可避免高胚胎抗性，分別是rcd-1r👨🏻‍🎨、CG4415和shu啟動子🧙‍♂️。而在靶向RpL35A基因的分離驅動中🕺🏽，任何無功能的抗性等位基因都會導致個體不可存活👨🏼‍⚕️。因此，胚胎抗性是有害的，帶有抗性等位基因的個體將會從種群中快速清除。除了帶有shu啟動子的Cas9元件👨‍👩‍👧🤦‍♂️，其他啟動子均展示了雄性的高驅動遺傳率☄️👨🏼‍🦲。相比EGFP合成驅動和靶向yellow的分離驅動，靶向yellow-G基因的歸巢抑製驅動有著更低的胚胎抗性🚶🏻‍♀️‍➡️。除了良好的性能參數🐿，它還有強烈抑製的潛力。相比nanos啟動子，已鑒定的啟動子的體細胞表達量沒有明顯降低，但是它們有更低的生殖系表達🧎‍♂️‍➡️，可降低適合度代價，其中一些啟動子有更低的胚胎抗性。相關實驗表明只有CG4415啟動子有著較高的卵成活率。

圖2  靶向yellow基因的驅動性能

在之前的研究中，Champer課題組發現果蠅的nanos啟動子，在單管雜交中展示出較少的適合度代價👩🏻‍🚒，但在籠子種群中有著明顯提高的適合度代價，這可能與nanos啟動子的高胚胎抗性有關[4]。本研究中，Champer課題組選擇了3個Cas9品系進行多代籠子實驗🏌️🤓，其中一個為rcd-1r啟動子和shu 3'UTR的組合😜，另外兩個為CG4415啟動子和nanos 3'UTR的組合（其中一個EGFP與Cas9方向一致🥶🏄🏻‍♂️，另一個放置於不同的染色體臂中）🧑🏽‍🦰。在由rcd-1r啟動子表達Cas9的籠子1中，驅動載體頻率緩慢增加，但始終低於27%，僅達到一個較低的平衡值。而由CG4415啟動子表達Cas9的籠子2，驅動載體頻率增加較快🧘🏿‍♂️🚵🏿，並且籠子種群最終得到抑製。後續實驗分別為大部分使用了較幹燥的食物和僅使用了新鮮的食物，更為幹燥的食物一組（籠子3）僅能達到平衡，新鮮的食物一組（籠子4）支持了籠子2結論。此外，本研究還使用了位於“site C”位點的CG4415-Cas9元件分別進行了3次籠子試驗（籠子5—7），由於Cas9元件帶有的雌性雜合子適合度代價較低，驅動載體頻率增加並且最終抑製了種群，但是這些籠子的種群規模相對較低💍。本研究認為，CG4415啟動子在籠子中的適合度代價明顯低於nanos啟動子和rcd-1r啟動子。並且與nanos啟動子相比🔝，CG4415啟動子的胚胎抗性顯著降低📕，這足以抑製大型🍖、強健的果蠅籠子種群。

圖3 歸巢抑製驅動的多世代籠子實驗

綜上所述🆘，本研究表明♒️，通過組合不同的Cas9的啟動子、5'UTR和3'UTR等調控元件，能夠有效提高歸巢驅動的效率🦶🏼。在不同的驅動系統中🦧，Champer課題組鑒定了不同啟動子的優勢和劣勢，以及它們與不同驅動元件的相互作用🏊🏿‍♀️。這些調控元件為果蠅的驅動系統提供了較大的優勢🧞‍♀️，它們的同源物在其他物種中也可作為有用的潛在候選者🧑🏽‍🏫🍲。

意昂3体育官网生命科學學院博士後杜捷為本論文的第一作者，Jackson Champer和杜捷為論文的通訊作者⛰。2022級清華大學PTN項目博士生陳為哲、科研助理賈熙華、博士後徐雪嬌🚯、實習生周睿知、2021級意昂3体育官网生命科學學院本科生張雨琪、康奈爾大學本科生Emily Yang和Matt Metzloff，康奈爾大學Philipp W. Messer助理教授等多位成員對本論文有著重要貢獻。該研究得到了意昂3体育官网、意昂3体育-清華生命科學聯合中心🤵‍♂️🧖‍♀️、國家自然科學基金、意昂3体育官网生命科學學院啟東創新基金、美國國立衛生研究院獎等機構和經費的大力支持。

參考文獻🕺🏽：

1. Champer, J., Buchman, A. & Akbari, O. S. Cheating evolution:engineering gene drives to manipulate the fate of wild populations. Nat. Rev. Genet. 17, 146—159（2016）

2. Wang, G.-H. et al. Symbionts and gene drive: two strategies tocombat vector-borne disease. Trends Genet. 37, 708—723 （2022）

3. Champer, J. et al. Molecular safeguarding of CRISPR gene driveexperiments. Elife 8, e41439（2019）

4. Yang, E. et al. A homing suppression gene drive with multiplexedgRNAs maintains high drive conversion efficiency and avoidsfunctional resistance alleles. G3 Genes|Genomes|Genetics. 12, jkac081（2022）