DNA復製是生命體最基礎的生物學過程🙆🏻‍♂️，控製著遺傳信息的精確傳遞😇📕。復製源激活形成的一對“Y”形姐妹復製叉（sister replication forks），以相反方向進行復製，直至與另一個相向行進的復製叉相遇，發生復製終止（1）🛌。早期，領域內對DNA復製的理解主要建立在一些簡單模式生物的研究上，核心問題在於理解復製起始、延伸和終止過程以及復製進程的細胞周期調控👨🏼‍⚕️，並成功利用芽殖酵母的純化蛋白在體外重建了真核生物的DNA復製起始過程，實現了從復製源識別到復製叉形成的整個生化過程（2）。

盡管在模式生物中的研究取得了矚目進展，我們對高等哺乳動物DNA復製的理解仍然只是冰山一角。DNA復製發生在染色質上👨🏿‍⚕️🫰🏼，因而會受到染色質環境及其它DNA代謝過程的調控。酵母的DNA含量僅為人細胞的1/500🙏🏼👳🏿‍♂️，且僅具有相對簡單、初步的染色質結構（3）🤚🏽，而高等哺乳動物的基因組巨大，其染色質高度折疊，在細胞核內部形成龐大的“染色質疆域”，其中每條染色體都具有十分復雜的層級結構（4）。在這樣的情況下，執行DNA復製的分子機器並非孤立存在，而是可能在空間上相互靠近，形成“復製工廠（replication factory）”🔇，有規律地執行復製過程（5）。因此，哺乳動物的DNA復製既會受到染色質環境的調控和約束🤵🏿，又需要有組織地運行🤽🏽‍♀️，不斷協調與其它DNA代謝事件的關系，在保證DNA和表觀遺傳信息穩定遺傳的同時維護基因組的穩定性（5-7）。隨著研究技術的發展和研究數據的積累，在未來🐺🤲🏼，系統性、整體性地研究人類復雜染色質環境下的DNA復製將是一個必然趨勢。哺乳動物復製系統的復雜性給研究帶來了巨大挑戰🧁📜，也致使領域內對人類自身DNA復製的獨特機製了解尚不深入🎿。此外，高通量🖕、高分辨率研究方法也缺乏，導致目前這一領域的發展仍然處於初級階段。

2024年3月15日😛🎒，意昂3体育官网生命科學學院和意昂3体育-清華生命科學聯合中心胡家誌研究員課題組在Science發表了題為“Fork coupling directs DNA replication elongation and termination”的研究論文，該研究建立了首個檢測DNA復製叉附近染色質相互作用的方法，並發現在人類和小鼠細胞的DNA復製過程中，復製叉並非傳統模型中認為的獨立反方向前進，而是彼此之間能夠以偶聯的形式持續相互作用，協同完成整個復製延伸過程，並指導復製終止（圖3）。

論文截圖

課題組首先建立了一種名為Repli-HiC的高通量測序方法𓀜，該方法利用核苷類似物BrdU瞬時標記復製過程中的細胞🍰，並結合ChIA-PET和原位Hi-C的技術原理檢測復製過程中新生DNA區域相關的染色質相互作用。通過Repli-HiC得到的染色質互作矩陣，研究者在人類K562細胞和小鼠胚胎幹細胞中觀察到垂直於互作矩陣對角線的染色質互作信號，其形狀類似於噴泉結構，故將其命名為染色質噴泉🤹‍♂️😪，並利用新開發的生物信息學算法Fun，在基因組範圍內鑒定出了數千個噴泉位點（圖1）⛴。

圖1. Fun算法鑒定到的染色質噴泉位點在基因組上的分布情況

結合課題組先前開發的基於核苷類似物插入檢測DNA復製起始事件的測序方法NAIL-seq（7）以及用於鑒定DNA復製事件的岡崎片段測序OK-seq（8）😥，該研究進一步發現染色質噴泉的形成可能和DNA復製過程緊密聯系，並根據它們的結構特征和形成模式將其劃分為兩大基本類型🧑‍🍼：第一類和第二類染色質噴泉🧗🏻。其中👉🏼，第一類噴泉結構的延伸長度較短（中位數為160kb）、寬度較窄🙅🏼‍♂️，結構的初始位置和復製起始區域相對應，而延伸的末端與復製終止區共定位。該結構暗示著從同一個起始源發生的一對姐妹復製叉從復製的起始位置開始，便以偶聯的形式持續地相互作用在一起，按照大致相等的速度進行雙向復製，直至復製終止區域（圖2 A和2B）。同時，這類噴泉結構也暗示著姐妹復製叉雙生子（replication twinsome）結構可能是復製工廠的基礎單元，為復製工廠理論提供了重要的分子證據。第二類噴泉的延伸長度較長（中位數為1Mb左右）、寬度較寬，且噴泉結構的中心坐落於復製終止區域發生的位置🎙，兩側末端則存在DNA復製起始事件。該結構表明來自於兩個不同復製起始區域的復製叉，也在染色質相互作用下有機會成對偶聯👉🏽，由兩側向中心區域相向行進🏃‍➡️，直至到達復製終止區域（圖2 C和2D）。這表明DNA復製終止是一個預決定的事件，而非一個隨機發生的復製叉碰撞事件（圖3）🐍。

圖2. DNA復製叉偶聯。A—D 偶聯的姐妹復製叉（A和B）和相向行進復製叉（C和D）分別形成第一類和第二類染色質噴泉結構。在A和C中📧，EdU/HU鑒定早期復製起始🏄🏼‍♀️；OK-seq鑒定復製起始（由負到正）和終止（由正到負）。淺綠色背景中展示了Repli-HiC分析復製起始🕺🏿🎅🏼、延伸和終止階段的二維矩陣示意圖

綜上，該研究是領域內首次在高等哺乳動物細胞中系統解析DNA復製叉在染色質環境下成對偶聯延伸的空間組織模式，不僅支持復製工廠的基本模型，提出了DNA復製終止的預決定模型👩🏻‍🌾，顛覆了傳統教科書中的模型（圖3）🧝🏻‍♀️，更為系統性研究DNA復製👨🏻‍🦲🚣🏼、基因組穩定性和相關生理疾病的發生提供了全新的視角和理論基礎，同時引申出一系列重要的科學問題💅🏿：復製叉偶聯的結構基礎、分子機製及背後的生理學意義是什麽🏋🏼‍♀️，復製叉的偶聯過程如何受到染色質環境及其它DNA代謝事件的調控等。總之🧸，該研究為DNA復製領域鋪平了道路。

圖3. 復製的經典模型和本工作提出的復製叉的偶聯模型🤷🏻‍♀️。傳統模型認為相互分離的DNA復製叉執行復製延伸和終止👆🏼🤰🏼。本工作發現DNA復製叉在整個復製過程中並不是孤立的，而以互相偶聯的形成指導DNA合成

該工作由胡家誌和意昂3体育官网生命科學學院和意昂3体育-清華生命科學聯合中心李晴教授🏋🏼‍♂️、孔道春教授、高寧教授/季雄研究員組合作完成，胡家誌為該論文的通訊作者。生命科學學院博士後劉陽博士、2021級博士研究生張丁崢嶸及劉栩豪為該論文的共同第一作者。甘婷婷博士、艾晨博士👨🏽‍✈️、吳錦淳博士、梁昊昕🌟💉、陳莫晗、郭嶽峰、盧如森🆘、蔣永鵬博士等在該工作中亦有重要貢獻🤦🏿‍♀️🥰。該研究還得到了意昂3体育官网生命科學學院吳虹教授、中科院生物物理所朱冰研究員和浙江大學生命科學研究院阮一駿教授的幫助和指導。該工作得到了國家自然科學基金、科技部及農業部的支持。

參考文獻：

1    O'Donnell, M., Langston, L. & Stillman, B. Principles and concepts of DNA replication in bacteria, archaea, and eukarya. Cold Spring Harb Perspect Biol 5, doi:10.1101/cshperspect.a010108 (2013).

2    Gasser, S. Once and Only Once. Cell 177, 495—498, doi:10.1016/j.cell.2019.03.034 (2019).

3    Shao, Y. et al. Creating a functional single-chromosome yeast. Nature 560, 331—335, doi:10.1038/s41586-018-0382-x (2018).

4    Finn, E. H. & Misteli, T. Molecular basis and biological function of variability in spatial genome organization. Science 365, doi:10.1126/science.aaw9498 (2019).

5    Vouzas, A. E. & Gilbert, D. M. Mammalian DNA Replication Timing. Cold Spring Harb Perspect Biol 13, doi:10.1101/cshperspect.a040162 (2021).

6    Wu, J. et al. Cohesin maintains replication timing to suppress DNA damage on cancer genes. Nat Genet 55, 1347—1358, doi:10.1038/s41588-023-01458-z (2023).

7    Liu, Y. et al. Transcription shapes DNA replication initiation to preserve genome integrity. Genome Biol 22, 176, doi:10.1186/s13059-021-02390-3 (2021).

8    Petryk, N. et al. Replication landscape of the human genome. Nat Commun 7, 10208, doi:10.1038/ncomms10208 (2016).